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Item Name NGS （Next Generation Sequencing)
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项目名称 二代测序;大规模平行测序或深度测序
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其他名称 高通量测序方法
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百书编码 wk.hyr.21.0009
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主编 Gary
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修改时间戳 2021/7/24
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项目简介
NGS技术NGS技术又称大规模平行测序或深度测序，包括第二代 (通俗意义上讲二代即为NGS)、第三代和第四代测序技术。目前，具代表性的
第二代 :
瑞士Roche公司的454，
美国Illumina公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA）、HiSeq 2000和MiSeq，
美国ABI公司的寡聚物连接检测测序（sequencing by oligo ligation detection， SOLiD）5500XL，
美国Life TYechnologies公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪（personal genome machine，PGM）；
第三代 :
美国HelicosBiosciences公司的HeliScope遗传分析系统
PacificBiosciences公司的单分子实时（single moleculereal time，SMRT）测序技术；
第四代 :
英国Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序技术。
二代技术不同公司技术简介
Roche 454公司首选将焦磷酸测序应用在测序技术上，之后便被罗氏诊断收购，形成了目前的Roche 454。待测DNA样品被打断成300-800bp的片段后，3和5端分别加上接头，这些接头会使DNA片段结合到微珠上。测序PCR反应就发生在固相的微珠上，并且整个PCR反应和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含1个DNA模板。扩增后，每个DNA分子可以得到富集，每个微珠只能形成一个克隆集落。454测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳一个微珠。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就可以达到DNA测序的目的。相对于Sanger测序，Solexa和Solid测序而言，454可以提供中等的读长和适中的价格，适合de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。
Solexa的测序原理是可逆终止化学反应。DNA片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着DNA 3端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。和焦磷酸测序不同，每次DNA的只能延伸一个核苷酸。Solexa的读长在100-150bp之间，适合小RNA鉴定、甲基化和表观遗传学研究。
ABI Solid技术的核心是4种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序。测序之前，DNA模板通过乳化PCR扩增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3端修饰的微珠可以沉淀在玻片上。连接测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品DNA就可以被探针标记。DNA连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。Solid的读长只有50-75bp，精确度可达Q40，适于基因组重测序和SNP检测。
三个厂家的高通量测序仪器虽然各具特点，在原理上很多的共同之处：
1 将目标DNA剪切为小片段
2 单个小片段DNA分子结合到固相表面
3 单分子独立扩增
4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号
5 高分辨率的成像系统 [1]
高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。在高通量测序发展的过程中，也有很多的问题需要我们去解决：数据在临床诊断上的作用，测序数据的储存和分析，数据的安全和信息隐私等。
NGS发展史自2000年初开始，测序技术得到了快速的发展。其中半导体测序平台和第3代单分子实时DNA测序平台以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合，成过程中磷酸二酯键3 OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8500 bp [1]
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参考文献
[1] CHAISSON M J，HUDDLESTON J，DENNISM Y，et al. Resolving the complexity of the human genome using single-molecule sequencing[J].Nature，2015,517（7536）：608-611.
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